Al expresarse abundantemente en el cerebro y debido a su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica, se liberan y están presentes en la sangre directamente después de una lesión de las células nerviosas. Pueden estar regulados al alza o a la baja como resultado de procesos celulares adaptativos. Tienen la ventaja de ser relativamente estables cuando se almacenan en fluidos biológicos, lo cual es un requisito esencial para su uso clínico. Por último, como los miARN están asociados a la actividad genética y a las vías de señalización molecular, la bioinformática puede utilizarse para caracterizar el papel de los miARN implicados en procesos como la neuroplasticidad, la neuroinflamación o la neurodegeneración.
El objetivo principal de este estudio será evaluar los efectos de los impactos accidentales en la cabeza (conmocionales y no conmocionales) y del juego repetitivo con la cabeza en el fútbol sobre los niveles circulantes de miARN, teniendo en cuenta los efectos del ejercicio de alta intensidad por separado. Asimismo, el uso de la bioinformática permitirá identificar los genes diana de los miRNAs implicados para definir sus funciones en los procesos biológicos y las vías de señalización.
Material y método
Diseño del estudio y participantes
Este trabajo se basa en un estudio de cohorte prospectivo previo en el que se realizó un seguimiento de jugadores de fútbol de la primera división noruega durante 2 temporadas consecutivas (2004 y 2005). La edad de los jugadores oscilaba entre los 18 y los 35 años.
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Impactos accidentales en la cabeza durante un partido (conmoción y no conmoción)
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El juego de cabeza repetitivo durante el entrenamiento
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Ejercicio de alta intensidad
Los niveles de miARNs se midieron específicamente a 1h y 12h después de cada una de estas situaciones y se compararon con los valores de referencia en reposo.
Impactos accidentales en la cabeza durante un partido
Se tomaron 35 muestras de sangre antes de la temporada 2005 para que sirvieran de referencia para los impactos accidentales en la cabeza. Durante la temporada, se tomaron muestras 1h y 12h después de los impactos en la cabeza que implicaban un alto riesgo de lesión. Se disponía de 35 muestras (21 no conmocionantes y 14 conmocionantes) 1h después y 19 muestras (11 no conmocionantes y 8 conmocionantes) 12h después del impacto.
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Un jugador parece haber sido golpeado en la cabeza (incluyendo la cara y el cuello).
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El partido fue interrumpido por el árbitro.
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El jugador se queda en el suelo durante al menos 15 segundos.
Los tres criterios debían cumplirse para que el incidente fuera incluido.
Todos estos impactos se subcategorizaron como eventos conmocionantes o no conmocionantes en función de los síntomas comunicados al personal de investigación por el jugador o el personal médico. De acuerdo con el Consenso de Viena de 2001, la conmoción cerebral se definió como un golpe directo o indirecto que produce un deterioro neurológico a corto plazo.
Juego de cabeza repetitivo y ejercicio de alta intensidad
Se celebraron dos sesiones de entrenamiento, en dos días diferentes, en las que participaron 48 jugadores de diferentes equipos.
La primera consistió en ejercicios de alta intensidad únicamente, sin permitirse juegos de cabeza.
La segunda sesión incluía cabeceos repetitivos, modelados en la medida de lo posible en situaciones típicas de juego, como ejercicios a balón parado y de córner, variando la velocidad y la distancia del balón. Durante esta sesión, la intensidad de los ejercicios fue especialmente baja. Durante la sesión se registró una media de 19 remates de cabeza por jugador.
Por la mañana, antes de la primera sesión, se tomaron 47 muestras en reposo como referencia para las dos sesiones de entrenamiento.
A continuación, se recogieron nuevas muestras 1h y 12h después de cada una de las dos sesiones. Así, se dispuso de 38 muestras a la 1h y de 30 a las 12h después de los repetidos juegos de cabeza.
37 estaban disponibles a la 1 de la madrugada y 33 a las 12 de la noche para realizar ejercicios de alta intensidad.
Identificación de miARNs desregulados
La identificación de miRNAs desregulados implicó dos pasos, el cribado y la validación. En la fase de cribado, se agruparon las muestras de cada uno de los 10 grupos (2 grupos de referencia y 8 grupos de análisis) para identificar los miARN primarios. En la fase de validación, estos resultados primarios se validaron en muestras individuales de cada grupo para identificar miRNAs desregulados.
Selección de muestras y examen de los ataques de miarnas primarios
De un total de 274 muestras, se incluyeron 89 para la fase de cribado con el fin de identificar los miRNAs que estaban desregulados, ya sea por encima o por debajo, del valor de referencia. En concreto, para este paso se incluyeron 9 muestras (8 muestras de conmoción a las 12:00) de los 10 grupos.
Selección de muestras y validación de los ataques de miARNs primarios
Tras el paso de cribado, se analizaron 98 de las 274 muestras disponibles para validar o no los resultados primarios de miARN. Para este paso de validación, se seleccionaron específicamente 10 muestras (8 muestras de conmoción cerebral a las 12 horas) de forma aleatoria entre los 10 grupos. Cualquier alteración en el número de miARNs en comparación con la línea de base se definió como miARN desregulado.
Resultados
En la fase de cribado, se identificaron un total de 38 miARNs primarios en uno o más puntos temporales en una o más situaciones.
En el paso de validación, 20 de estos miARN primarios se confirmaron como desregulados.
impactos accidentales en la cabeza durante un partido
Tras los impactos accidentales de la cabeza sin conmoción, se detectaron 9 miARNs desregulados. 8 de ellos se modificaron después de 1h y 1 después de 12h.
Tras la lesión por conmoción, se detectaron 2 miARNs desregulados (miR-204-5p y miR-130b-3p), que no se vieron afectados por el ejercicio de alta intensidad. Ambos se alteraron después de 1h mientras que ninguno se alteró después de 12h. Mientras que miR-130b-3p también se vio afectado por impactos no conmocionantes, sólo se observaron niveles elevados de miR-204-5p 1 h después de impactos conmocionantes en la cabeza.
6 de los 9 miARNs (miR16-5-p, miR-18a-5p, miR-20a-5p, miR-93- 5p, miR-107 y miR-130b-3p) no se vieron afectados por el ejercicio de alta intensidad.
Tras la lesión por conmoción, se detectaron 2 miARNs desregulados (miR-204-5p y miR-130b-3p), que no se vieron afectados por el ejercicio de alta intensidad. Ambos se alteraron después de 1h mientras que ninguno se alteró después de 12h. Mientras que miR-130b-3p también se vio afectado por impactos no conmocionantes, sólo se observaron niveles elevados de miR-204-5p 1 h después de impactos conmocionantes en la cabeza.
Juego de cabeza repetitivo y ejercicio de alta intensidad
Después de repetir los aciertos de cabeza, se detectaron 8 miARNs desregulados. Los 8 fueron desregulados después de 1h y 1 también después de 12h.
6 de ellos (miR-24-3p, miR-27a-3p, miR- 122-5p, miR-150-5p, miR-499a-5p y miR-885-5p) no se vieron afectados por el ejercicio de alta intensidad.
En respuesta al ejercicio de alta intensidad, se detectaron 7 miARNs desregulados. De ellos, 3 se desregularon después de 1h y 4 después de 12h, sin que hubiera duplicación entre los dos puntos temporales.
Identificación de los géneros objetivos de los miARNs
El ejercicio de alta intensidad implicó un mayor número de genes dirigidos con actividad catalítica, y los impactos accidentales en la cabeza se caracterizaron por genes únicos que afectan a los reguladores traslacionales y a la actividad de las vías reguladoras.
Se identificaron conjuntos de vías de señalización en las tres situaciones. El impacto accidental se relacionó con 12 vías de señalización específicas, los golpes de cabeza repetitivos con 1 vía y el ejercicio de alta intensidad con 31 vías.
Además, los impactos accidentales y el ejercicio de alta intensidad compartieron 10 vías de señalización, mientras que los golpes de cabeza repetitivos y el ejercicio de alta intensidad compartieron una vía de señalización.
Discusión
Este estudio evaluó los efectos a corto plazo de los impactos accidentales en la cabeza, el juego repetitivo con la cabeza y el ejercicio de alta intensidad en el fútbol sobre la circulación de los miARN.
Hay tres conclusiones principales. En primer lugar, los impactos accidentales en la cabeza provocaron la desregulación de 6 miARNs específicos y sus genes diana se vincularon a 12 vías de señalización específicas, principalmente la regulación de la organización de la cromatina, la señalización Hedgehog y la señalización Wnt.
En segundo lugar, el conjunto de cabezas repetitivas condujo a la desregulación de seis miARNs específicos, y sus genes diana se vincularon a una vía de señalización específica, el TGF-β.
En tercer lugar, el ejercicio de alta intensidad provocó la desregulación de 7 miARNs, cuyos genes diana estaban conectados a 31 vías de señalización específicas.
En conjunto, estos resultados muestran que los impactos accidentales en la cabeza y el juego repetitivo con la cabeza en el fútbol conducen a alteraciones específicas en la circulación de miARNs que no se ven afectadas por el ejercicio de alta intensidad. Por lo tanto, este estudio sugiere que los miARNs pueden servir como biomarcadores de lesiones cerebrales. Además, los miARNs pueden tener el potencial de diferenciar la gravedad de estas lesiones.
Impactos accidentales en la cabeza
Curiosamente, al comparar los impactos conmocionantes y no conmocionantes, se descubrió que sólo los impactos conmocionantes provocaban un aumento de miR-204-5p 1 h después de la lesión.
Por el contrario, los choques no conmocionantes conducen a la regulación a la baja de varios miARNs. La regulación a la baja de miR-130b-3p fue compartida tanto por los impactos conmocionantes como por los no conmocionantes, lo que no ocurre en otros estudios en los que miR-130b-3p tiende a aumentar en las 48 h siguientes a una lesión cerebral traumática grave.
Esto pone de manifiesto la gran necesidad de considerar las diferencias en la gravedad del impacto y las características específicas del diseño del estudio.
Aquí se identificó un nuevo biomarcador potencial de la conmoción cerebral, miR-204-5p, que tiene la ventaja de ser naturalmente abundante, lo que hace que el análisis sea relevante desde el punto de vista fisiopatológico. Curiosamente, la regulación al alza de este miARN también se ha encontrado en la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson.
Los impactos accidentales en la cabeza están, según los análisis bioinformáticos, asociados a varias vías de señalización biológica. En su mayoría, están relacionados con las vías que regulan la organización de la cromatina, la señalización Wnt y la señalización Hedgehog.
Se ha demostrado que la señalización Wnt está implicada en la regeneración neuronal tras una lesión cerebral traumática.
La señalización de Hedgehog ha sido implicada en la inhibición de la apoptosis neuronal y en la reducción del daño de la permeabilidad celular tras una LCT en animales, lo que podría observarse de la misma manera en los seres humanos, y que corrobora las descripciones anteriores que muestran que la alteración de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica es una característica importante de la LCT.
Juego de cabeza repetitivo
Durante los partidos de fútbol, se demostró que un jugador profesional masculino pateaba el balón con la cabeza una media de 3 a 4 veces por hora de juego. Tras el desarrollo de un programa de entrenamiento craneal, se demostró que se alteraba el nivel de 6 miARNs que no se veían afectados por los impactos accidentales o el ejercicio de alta intensidad. Todos estos miARNs aumentaron casi inmediatamente (1h) y volvieron a sus niveles de referencia a las 12h.
Se encontró un aumento de miR-24-3p, en consonancia con otros trabajos sobre el tema, que es un objetivo prometedor para la detección de un biomarcador específico del impacto de la cabeza sin conmoción en el fútbol.
La falta de duplicación entre el juego de cabeza y los impactos accidentales es sorprendente. Esto puede reflejar el hecho de que los diferentes tipos de exposición a impactos en la cabeza tienen efectos diferentes en el cerebro, dependiendo de la magnitud del impacto y de su frecuencia.
El juego repetitivo con la cabeza se ha asociado con la señalización del TGF-β, con niveles elevados de TGF-β encontrados en el líquido cefalorraquídeo después de TBI, lo que puede sugerir un papel en la señalización antiinflamatoria y neuroprotectora. Una posible interpretación es que el juego de cabeza repetitivo desencadena respuestas neuroinflamatorias en el tejido neural.
Ejercicio de alta intensidad
La firma de miARN en respuesta al ejercicio varía considerablemente con el tipo de actividad y la intensidad. Se observaron cambios para diferentes miARNs a 1h y 12h después del ejercicio. El aumento más significativo se encontró para miR-206, que ya se sabe que es modificado por la actividad física y que también está implicado en la miogénesis. Aunque algunos autores consideran que este miARN forma parte del panel para detectar una LCT, los resultados del presente estudio muestran la falta de especificidad de miR-206 para detectar lesiones cerebrales en el deporte.
Los análisis bioinformáticos han detectado múltiples vías de señalización asociadas. Entre ellas, la señalización de TLR, FGF y ErbB son las más comunes. Se sabe que el ejercicio regula los procesos inmunitarios a través de varios procesos, incluida la señalización de los TLR.
Además, el ejercicio activa la señalización ErbB, que se sabe que permite la reparación cardíaca. También se han encontrado asociaciones entre el ejercicio y varias vías de señalización relacionadas con los procesos inmunitarios (como las citoquinas), pero también con la insulina y la señalización neurotrófica.
En particular, se encontraron varias vías de señalización comunes a las diferentes situaciones estudiadas. En particular, el ejercicio de alta intensidad y los impactos accidentales en la cabeza compartieron el mayor número de vías. Estos impactos en la cabeza se produjeron durante los partidos, que suelen implicar un ejercicio de alta intensidad poco antes del incidente. Los resultados sugieren que los efectos del ejercicio de alta intensidad sobre la circulación de miARN son numerosos y, por lo tanto, merecen una cuidadosa consideración.
Limitaciones del estudio
Factores como el tamaño de la muestra y el momento en que se toma, el tipo de almacenamiento de biofluidos, las características demográficas (incluidos los antecedentes), la gravedad de la lesión y los métodos empleados por el laboratorio deben tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados de estos estudios, que pueden dar lugar rápidamente a contradicciones.
La segunda limitación es que la exposición al impacto de la cabeza se caracterizó por la observación directa y el análisis de vídeo, lo que significa que no fue posible objetivar cuantitativamente las magnitudes del impacto en diferentes situaciones. Además, la distinción entre impactos conmocionantes y no conmocionantes se basó en una definición consensuada de 2001, que ha sido modificada desde entonces. Los autores tampoco pudieron registrar el número de disparos de cabeza realizados en el juego antes de un impacto accidental durante el partido.
Por último, el reducido número de muestras analizadas en cada grupo conlleva invariablemente el riesgo de sobreinterpretar los resultados obtenidos.
Conclusión
Este estudio exploratorio evaluó los efectos a corto plazo de los impactos accidentales en la cabeza, el juego repetitivo con la cabeza en el fútbol y el ejercicio de alta intensidad en la microcirculación de miARNs. Se demostró que diferentes tipos de exposición a impactos en la cabeza conducen a alteraciones específicas en el nivel de estos miARNs, algunos de los cuales se asociaron con vías de señalización que sugieren alteraciones cerebrales. Por lo tanto, los miARN pueden servir potencialmente como biomarcadores en las lesiones cerebrales.
Artículo de referencia
Stian Bahr Sandmo, Katarina Matyasova, Peter Filipcik, Martin Cente, Inga Katharina Koerte, Ofer Pasternak, Thor Einar Andersen, Truls Martin Straume-Næsheim, Roald Bahr & Igor Jurisica (2022) Changes in circulating microRNAs following head impacts in soccer, Brain Injury, DOI: 10.1080/02699052.2022.2034042
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